超出韓春雨新一代基因編輯技術在南京大學問

　　超越韩春雨新一代基因技术在南京大学问世

　　9月15日，基因组学一流期刊《Genome Biology》（IF：11.313）发表了来自南京大学的一项关于新型基因技术的突破性成果该文的通讯作者分别是南京大学医学院附属金陵医院的周国华教授、南京大学模式动物研究所赵庆顺教授和朱敏生教授同期，《Genome Biology》配发评论文章DNA-guided genome editing using structure-guided endonucleases近几年来，基因的发展一路高歌猛进，特别是今年5月河北科大韩春雨在《Nature Biotechnology》报导的有关NgAgo的争议论文横空出世更是让很多国内普通老板姓都开始渐渐了解基因了今天BioArt不再讨论NgAgo的重复性问题，让我们把目光转向南京大学近日发表的这1突破性成果BioArt有幸邀请到基因技术的实践者仪宏老师和蒋威博士特别撰写了一篇评论性文章，题为《源于天然，超出天然南京大学周国华教授DNA论文读后感》

　　2016年9月15日，《Genome Biology》报道了一种基于SGN的基因新技术，以结构引导的内切酶（SGN，Structure-guided nuclease）实现体内外DNA任意序列的靶向和切割论文1作为Shu Xu，论文通信作者为南京大学医学院附属金陵医院的周国华（Guohua Zhou）研究员、南京大学模式动物研究所的赵庆顺（Qingshun Zhao）教授和朱敏生（Minsheng Zhu）教授做为基因领域的从业者，读后很有感触，应BioArt主编之约请，以半学术的方式、以随笔的情势写出，与各位分享，不严谨之处请大家各自消毒

　　感触之一：构思巧妙，略有瑕疵，瑕不掩瑜

　　论文中，作者巧妙地融会FEN1（Flap endonuclease-1，是一种可以特异性识别flap结构的核酸内切酶，参与DNA的复制，修复和重组进程；除此之外它还具有双链DNA特异的的核酸外切酶活性）和已被成功用于ZFN和TALEN的DNA剪切结构域Fok I，结合标准化的linker（GS repeats），设计了一个chimeric protein，实现了可编程的基因系统，具有以下特点：短链ssDNA导向的基因组特定位置；结果是产生大片断的deletion（可以大于2.6kb）；可以在斑马鱼胚胎中成功内源基因这个构思，看得出包括ZNF和TALEN的影子，其实这三者设计思路是一致的，其创新点在于靶向元件的选择十分奇妙，切割元件直接me too令人惊喜的是，这种原创性工作出自我们中国科学家团队，略有遗憾的是，论文中体内靶点做的偏少，也没有以CRISPR或者TALEN为对比，致使尚不能够评估其相对低的效力是来自位点特异性障碍还是来自技术本身（znf703基因效率1/961%；cyp26b1基因效力是3/2910%、这个位点还真不低）另外一点，如果SGN系统结果是产生大片断的deletion，那么后期的同源重组做起来要相对困难（冒昧的揣测一下：FEN-1外切酶活性是否可以dead貌似大片断的deletion应该是的核酸外切酶活性引起的）

　　感触之2：表述质朴谦逊，留下很大的优化空间

　　通篇论文读下来，科学以外，还感觉到一种相对质朴的文风，措辞之间充盈着谦逊这么讲，可能超越了学术范畴，所以称之为随笔，既然自己给自己开了这么一个后门，所以

　　，干脆就谈出来，好在笔者与南京大学与作者没有关联，也就没有了套磁之嫌疑例如，在基本术语上作者没有跟风：SGN而不是ssDNA guided Nuclease，DNA editing而不是genome editing，这些细节都能够体现出一种独立性基因技术的效力是极其重要的，目前看在这篇论文中，作者没有更多地报道相干的条件优化工作，例如效率瓶颈是存在于guide DNA与靶向区域的结合效力还是存在于SGN的识别效率全部生物学场景之中，目标区域的DNA melting究竟有多重要是转录相关事件还是复制相干事件（冒昧的揣测一下：是否是质粒实验中采用可诱导启动子即可帮助判断）当然，不应该要求一篇论文解决和回答这么多的科学或技术问题，但是可以预计，这个新工具可能还有较大优化空间，期待着他们更多的进一步报导

　　感触之三：就是要挑战CRISPR，虽然它似乎难以逾越

　　众所周知，今年5月2日《Nature Biotechnology》发表河北科技大学韩春雨博士一鸣惊人的论文，报告了一种NgAgo-gDNA基因新工具，虽然因不可重复而使韩春雨一波三折地堕入学术诚信危机，但是，此文也算是高调地揭开了挑战CRISPR暗中比赛的盖子尽管CRISPR如日中天，乃至有long live CRISPR之类的戏言，但是，CRISPR并不完善，这种不完善不单单来自Off-target、PAM的限制性、难以实现单碱基精确之类的技术瑕疵，更是来自人类对新技术的天然贪婪，来自根深蒂固的奥林匹克精神更快、更高、更远，来自我们骨子里的征服欲正如哈佛大学医学院遗传学教授George Church所言：新技术都是脆弱的，随时可能被取代；加州大学圣迭戈分校的Prashant Mali说的更直白我们需要的不止这些所以，从技术使用者的角度看，CRISPR是大自然和几位先锋科学家送来的珍贵礼物，在欣然拥抱它的同时、固然也期待着更好的技术出现；从技术开发者的角度看，大红大紫般火热的CRISPR又是新的比赛标杆，它令人妒忌地、高傲地立在那里，挑逗和激起着人们超越它的冲动

　　感触之四：源自天然、超越天然，从基因技术演变史看工程化在技术工具开发中的重要性

　　有人把基因技术做了断代工程，给技术划代，很形象、也利于普及，但是有时候也比较困难一般地，理论上可以在哺乳动物细胞中近乎任意位点切割并引发的ZFN、TALEN以及CRISPR，它们在时间节点上依次出现、而且效率和便利性也越来越好，所以被称为第一代、第二代、第三代基因技术（1G、2G、3G）笔者愿意把他们称之为大众基因工具，由于对应着的还有一些小众工具，鉴于其本身的技术局限和缺点，并没有被大家普遍接受今天，先聊一聊大众工具，随后加1些小花边，再聊聊那些正在被淘汰和被遗忘的小众工具，补充这些小众工具的演变史，可以更加清晰地看出技术发展脉络，或许从中获得另外的灵感和启发

　　从大众工具看，工程化贯穿始终现代中文语境中，一直有一种混淆科学与技术的语义学窘境科学与技术相干但不相同，有人形象地这样辨别科学与技术：know what，know why是科学，know how是技术基因总体上是一种技术，其相关工具的开发，起步于科学发现，但是不止步于科学发现例如，从现有公开文献看，CRISPR最重要的科学发现节点是2011年卡彭蒂艾（Emmanuelle Charpentier）对tracrRNA的生物学功能的阐明但是，有时候，造物主很懒，他开辟了这个世界之随后可能置之不理了所以，大自然留给我们的礼物，有时候配不上我们征服的野心，因此，就人类目标而言，我们历来都不吝啬和迟疑于改进和再造果然，随后的2012年，卡彭蒂艾就会同詹妮弗刀娜（Jennifer A. Doudna）联合发表了划时代论文，把tracrRNA和guide RNA合二为一，做成了工程化的chimeric single guide，sgRNA由此诞生而在CRISPR-Cas工程化、模块化方面贡献最大的，应该首推华人科学家张锋教授除CRISPRi、 CRISPRa以外，早在2013年的综述中，张锋教授就展望了包括把Cas设计为光控模式在内的各类工程化方案而就是在本月，又推出了两项以遥控sgRNA的方式对CRISPR实施即时控制的技术方案哈佛和神户大学的团队前后发表了利用工程化措施将AID与dCas9做成chimeric protein实现了不依赖于同源重组的单碱基就在本月初，MIT的团队创建了光敏感的sgRNA技术；几乎与此同时，深圳的科学家团队报告了化学控制的sgRNA的控制技术

　　让我们把视野再回望到ZFN和TALEN，更是工程化的杰出案例，直至今天讨论的SGN，其动作模块甚至毫不动摇地使用FokⅠ，所变换进化的是GPS定位模块这堪称技术演变当中还留下了历史痕迹，好似守旧序列一样，让人惊叹自然进化与人工进化异曲同工之奇妙

　　所以，基因工具开发工程化的基本方程式是：GPS定位模块+履行模块话分两头说

　　先聊履行模块FokⅠ屡战屡胜，但是，一定还有其它选择，毕竟，造物主应该是慷慨的，地球生命演变了四十亿年，留下的自然遗产极为丰富

　　再聊聊GPS定位模块这个模块工作效率及操作便利性如何，是基因工具好不好使的关键ZFN和TALEN的主要特点是：以蛋白质特定结构域来完成靶向定位，其主要缺陷是：定位模块体外准备麻烦，工作量大本钱高；相比之下，CRISPR-Cas却方便的多，所以在整体竞争中胜出但是CRISPR-Cas还是或多或少存在Off-target的弊端，为了解决这个问题、进一步强化定位精准性，已有报导以dcas9为定位器，融会上FokⅠ，实现正义链和反义链双向定位、并形成FokⅠ二聚体造成DNA双链断裂（DSB）、引发本次讨论的南京大学的这篇文章，再一次创新了GPS定位模块，首次采用FEN-1（flap endonuclease-1）来执行定位功能，将定位指令转化为方便人工编程的guide-ssDNA，做的很奇妙

　　聊到这里，下一个创新近似于呼之欲出：虽然NgAgo仿佛失败了，但是它工程化改造的前景呢pAgo做为基因组GPS定位模块的可能性，怎能不令工具开发者怦然心动，就连我那个简陋的实验室，都已经于几个月前就开始努力了，万一大牛们漏掉了某些创意呢

　　总之，GPS定位模块+履行模块=基因工具，两个模块的重点是定位模块设计灵感源自天然存在的自然遗产、但不止步于天然存在自然界留给我们很多的提示和启发，例如：位点特异重组酶（site specific recombinase）如何整合酶（integrases）如何转座酶（transpotase）如何其它未知的recombinase如何这个领域的干法和湿法挖掘竞赛应该一直在进行张锋曾说到：通过对多种酶进行探索，我们可以得到一个更强的基因组工具箱我们必须继续探索未知

　　最后的花边：从G0谈起，回顾一下沦落为小众的基因工具

　　上世纪七十年代末，利用限制性内切酶实现了质粒体外重组，标志着第一代基因工程的诞生随后，基于同源重组的体内染色体水平的基因工程成为现实，但是由于重组率极低，必须使用抗生素抗性或营养缺点等标记加以挑选，做不到无痕以后，虽然发展了反向筛选标记、cre位点预埋及抗性回收等技术措施，但是，还是繁琐和低效业界对无标记的无痕基因技术是十分期待的，无标记无痕的关键在于效力，只要效力达到百分之一以上的数量级别，就有希望这里让我们一起回顾一下两个小众工具，作为绿叶来衬托一下广为人知的大众工具

　　其一，G0代的重组工程（Recombineering）上世纪90年代末，基于噬菌体的Red重组酶的重组工程（Recombineering）出现了，这个领域中，中国科学家于代冠（Daiguan Yu）跟随NIH的Donald L . Curt，做出了不少贡献，于代冠博士后来回到了中科院广州生物医药与健康研究院基于Red系统，哈佛大学George Church于2008年在《Nature Biotechnology》上发表了改进版的MAGE，可以自动化地在数天内引发十亿计的突变；至2013年，Church又把基于ss-oligo的的重组工程从大肠杆菌扩展到酿酒酵母，这个进程还与rad51/rad54相关，被Church发展成YOGE技术，之所以特别强调Church，是由于这位伟大的科学家也是初期CRISPR的推进者之一，他采用Cas9高等细胞基因组的论文，与张锋同框于2013年1月的Science但是，重组工程终究没有能够再扩展到其它物种，特别是没有实现哺乳动物细胞的基因大肠杆菌的Red/ET系统，也是重组工程的重要实现工具，也是目前仍在普遍使用的分子生物学基本操作工具，这个系统源自中国科学家张友明在欧洲留学工作期间做出的开创性工作，张友明博士后来回到山东大学工作总体上，基于寡核苷酸入侵的重组工程可扩展性不够好（局限于原核的细菌、真核最多跨到酿酒酵母），效率相对低下（在千分之一到百分之一之间），难以大幅度优化

　　其二，G2.5代的Targetron这个来自原核微生物防御机制的Targetron技术，笔者更愿意把它称之为2.5代技术，不是由于它的效力，而是由于它的GPS定位模块的工作方式，其方式是结合了个别DNA位点的蛋白质识别和其它位点的RNA辨认，而且识别序列是可的、可以reprogrammable的这个工具的大本营首推德克萨斯大学奥斯汀分校，他们有对外开放的设计软件及一些技术服务，但是，它复杂、使用困难、物种可扩展性不高，梭状芽孢杆菌是可以用的，中科院微生物所李寅组和上海的杨晟组都有相干工作总之，仍然是一个小众工具

　　SGN将会如何是小众工具还是能够发展成大众工具呢pAgo能不能进一步W为NgAgo正名能不能正名之后再发展成大众工具呢前提是solid、可重复，并且用户友好让我们拭目以待吧

　　源于天然而超出天然，正道也再次祝贺南京大学科学家在基因领域的这项重大突破